Říha, J. – Manga, I. - Vyletělová, M. (Agrovýzkum Rapotín s.r.o.)
V rámci řešení výzkumného záměru MSM2678846201 byl autorským kolektivem vytvořen software ColonyCounter 1.0. Cílem autorizovaného software je zaručení opakovatelnosti a reprodukovatelnosti výsledků při odečítání kolonií na Petriho miskách. Software slouží k automatizovanému určení počtu bakteriálních kolonií na digitálním obraze (ve stupních šedé) ze skeneru.
Vstupem jsou naskenované digitální obrazy Petriho misek s kultivačním médiem a bakteriálními kolonami. Dále je možné na obraz aplikovat digitální filtry (spline transformace), které mohou zlepšit klasifikaci jednotlivých pixelů obrazu. Software je určen jako alternativní metoda pro tzv. konvenční způsob kultivace při analýzách menšího počtu vzorků nebo pro kalibraci přístrojů, např. Bactoscan. Celkový počet mikroorganismů se stanovuje v různých zkouškách mikrobiální kvality mléka, mléčných výrobků, vody apod. Jako kultivační médium se obvykle používá agarová půda s obsahem tryptonu (nebo peptonu apod.), glukózy, kvasničného extraktu, které je různě obohaceno např. o sušené mléko. Kultivace probíhá podle růstové náročnosti při teplotách od 4°C po 45°C (od psychrofilních, přes psychrotrofní, mezofilní až po termofilní mikroorganismy).
Pro stanovení počtu narostlých kolonií (KTJ/ml nebo KTJ/g) se obecně hodnotí Petriho misky s počtem kolonií od 15 do cca 300 KTJ. Odečet se provádí přímo proti světlu pouhým okem nebo se používají různé čtečky kolonií. Při odečtu je důležitá opakovatelnost, popřípadě reprodukovatelnost výsledků při rozhodování o počtu kolonií, kdy se již jedná o uznání vzorku. Např. norma pro pitnou vodu stanovuje limit pro mikroorganismy rostoucí při teplotě 36°C < 20KTJ/ml, norma pro syrové kravské mléko uvádí počet mezofilních mikroorganismů < 10.104 KTJ/ml. Při vyhodnocování počtu kolonií dochází k rozporným výsledkům při odečtu jedné i více osob. V laboratoři je nutnost kontinuálních prací včetně substituce osob tak, aby docházelo ke spolehlivým výsledků podle nejistot měření. Uvedený software nabízí vyřešení této problematiky.
Software může být využitý ve všech mikrobiologických laboratořích, kde se stanovuje celkový počet mikroorganismů, tzn.laboratoře servisní až po velké Centrální laboratoře. Software eliminuje případnou substituci osob v laboratoři při hodnocení výsledků a podporuje spolehlivý výsledek v servisní i kontinuální výzkumné činnosti při použití scanneru, případně využití plné automatizace analýzy.
Software v prvním kroku odseparuje pozadí obrazu, kultivační médium a misku. Odseparování pozadí je provedeno pomocí algoritmu storjového učení založeného na principu rozhodovacích stromů. Pro každý pixel digitálního obrazu je průchodem rozhodovacím stromem rozhodnuto, zda se jedná o pozadí či bakteriální kolonii (přesnost 97.65 % v interní kalibraci). Tento postup umožňuje kalibraci rozhodovacího stromu na konkrétní laboratorní podmínky. Strom je umístěn v samostaném souboru (dtree) v textovém fomátu, lze tedy současně využívat různé kalibrační modely. Dále je provedena shluková analýza pixelů obrazu, které byly klasifikovány jako pixely nesoucí informaci o bakteriální kolonii. Na základě nastavitelných parametrů:
- minimální velikost kolonie,
- maximální velikost kolonie,
- cirkularita,
- detekce lineárních útvarů (poměr obsahu útvaru k jeho obvodu),
software určí, zda shluk pixelů klasifikovaných jako bakteriální kolonie splňuje definované podmínky. Pokud shluk splňuje nastavené parametry, je započítán jako bakteriální kolonie do jejich celkového počtu na obraze misky. Po skončení shlukové analýzy software vypíše výsledný počet kolonií splňující definované podmínky na obraze. Shluková analýza je implementována pomocí dynamických kontejnerů, což umožňuje v reálném čase provádět analýzu na digitálních obrazech vysokého rozlišení.
Dále software vypíše do konzole výstupy testu a jeho parametry. Vytvoří jednoznačný hash testu, který je vytvořen pomocí funkce MD5. Hash je vytvořen na základě údajů testu jako název testovaného obrazu, jeho velikost, datum a čas provedení testu, identifikaci počítače na němž byl test proveden, nastavení parametrů pro kolonie, počet stanovených kolonií. Na základě tohoto hashe je možné jednoznačně určit bezespornost a pravost provedeného testu. Výstup je možné uložit, ukládá se provedený výsledek analýzy kolonií a obsah konzole. Jména souborů obashují aktuální hash. Výstup v konzoli je možno považovat za „průvodní lístek“ každého testu. Na jeho základě lze test kdykoliv opakovat, přičemž vytvořený hash musí souhlasit s původním. V případě nesouhlasného testu je možné výsledky rozporovat. Tyto možnosti dávají software možnost rutinního využití v akreditovaných laboratořích.
V současné době je software volně dostupný na stránkách společnosti (stažení programu). Zájemcům z řad laboratoří nabízíme možnost kalibrace software a individuálního přizpůsobení výstupů, případně úpravu software pro automatizaci měření.
Software je vytvořen ve vývojovém prostředí Boland Delphi 2005 (www.borland.com) s využitím komponent DIContainers 3.0 (http://www.yunqa.de/delphi/doku.php/products/containers/index). V balíku je přiložen rovněž digitální obraz misky z kalibračního souboru, který umožňuje uživatelské testování software.
Software byl vytvořen s podporou výzkumného záměru MŠMT MSM2678846201.
Publikace předcházející software
VYLETĚLOVÁ M., HANUŠ O., BENDA P., KOPUNECZ P. (1998): Psychrotrophic and total bacteria counts in raw cow´s milk. Veterinářství, 9 (48): 373-374. ISSN 0506-8231.
VYLETĚLOVÁ M. (1998): Stanovení celkového počtu psychrotrofů v bazénových vzorcích mléka svozné oblasti severní a střední Moravy. Bulletin Výzkumného ústavu pro chov skotu, Rapotín, Výzkum v chovu skotu, 4: 9-13. ISSN 0139-7265.
VYLETĚLOVÁ M., BENDA P., HANUŠ O., KOPUNECZ P. (1999): Determination of total counts of psychrotrophic bacteria in pool milk samples and their relation to total counts of microorganisms. Czech J. Food Sci., 17: 216-222. ISSN 1212-1800.
VYLETĚLOVÁ M., HANUŠ O., URBANOVÁ E. (1999): Occurence and identification of proteolytic and lipolytic psychrotrophic bacteria in bulk samples of cow´s milk. Veterinářství, 11 (49): 480-482. ISSN 0506-8231.
HANUŠ O., JANŮ L., VYLETĚLOVÁ M., KOPECKÝ J., JEDELSKÁ, R. (2005): Rozdíly ve zdravotních a hygienických ukazatelích syrového kravského mléka mezi stájemi s technologií trojího a dvojího dojení denně. Výzkum v chovu skotu, 2: 1-7. ISSN 0139-7265.
VYLETĚLOVÁ M. (2005): Kvalita bazénových vzorků mléka na severní Moravě. Výzkum v chovu skotu, 2: 18-23. ISSN 0139-7265.
VYLETĚLOVÁ M., NEJESCHLEBOVÁ L. (2007): Celkový počet mikroorganismů a výskyt patogenů v ekologických a konvečních chovech. Agromagazín, Vol. 5: 30-32. ISSN 1214-0643.